现在，转录组测序已经是开展分子生物学研究、基因功能研究、分子机制研究中不可或缺的一种技术手段。在进行转录组测序之后，往往需要对分析结果中感兴趣的内容进行生物学验证。转录组测序相关的研究可从基因/转录本表达、结构分析和RNA修饰等多个维度出发，因而可以基于此，从表达、序列或功能等方面形成完整的验证实验思路。围绕这个思路，以下提供了最为全面的转录组测序下游实验验证方法。

1. 荧光定量PCR（qRT-PCR）验证基因或者转录本表达情况

通过荧光定量PCR验证基因表达水平，基于内参基因（管家基因：维持细胞基因代谢活动所必需的基因，在各组织和细胞中表达相对稳定）的表达水平，获得目标基因的相对定量水平，常见的内参基因包含GAPDH、β-Actin、18S rRNA等。

注：因qRT-PCR与转录组测序定量原理不同，一般建议关注基因表达趋势是否一致。

（Zhou B, et al. Eur. J. Immunol.2023）

2. Western Blot验证蛋白表达情况

通过Western Blot（免疫印迹法）验证差异基因是否在翻译水平发生变化，应用特异性抗体，标记蛋白水平变化。其原理是利用蛋白质所带分子量不同，在凝胶电泳中产生不同的电泳速度而被分离。分离后的蛋白质被转移到PVDF 膜或 NC 膜上，以固相中的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。常见的抗体类型包括兔抗、羊抗、鼠抗等。

注：研究表明，蛋白质与转录水平的相关性较弱，因此建议在研究功能层面时，进行蛋白质层面的验证。

（Pierattini B, et al. Mol Ther-Nucl Acids.2023）

3. Northern blot验证RNA含量

通过Northern blot验证RNA的表达情况，且对目的片段大小检测有较高的灵敏度：Northern Blot 采用琼脂糖凝胶电泳，根据分子量大小不同将不同的RNA分离开来，然后将其原位转移至固相支持物（如尼龙膜、纤维膜等）上，再用标记过的DNA或RNA探针，依据碱基互补配对的原则进行杂交，随后进行显影或显色，以检测目标RNA所在位置，其显影强度则可指示目标RNA在所测样品中的相对含量。

（Kurihara Y, et al. Commun Biol. 2023）

1. RT-PCR验证可变剪切

通过RT-PCR验证可变剪切，其原理是在剪切事件发生区域设计特异性引物以扩增特定片段，通过电泳分离产物并观察条带大小差异，从而验证是否存在不同的剪切形式。步骤为根据IGV浏览器确定发生的事件及对应区域的序列，在序列区域附近设计特定引物，进行PCR扩增，确定片段长度。

（Zhang H, et al. Physiol Plantarum.2023）

2. RACE验证Poly(A)

3' RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）是研究mRNA 3’末端的常用手段，因为mRNA可能具有多个3’末端 PAC区域，因此可根据该特性设计实验进行Poly(A)验证。区别于普通的RT-PCR，3' RACE验证需要扩增出mRNA 3’末端的所有条带，所使用的引物相对比较特殊，正向引物选取在近端Poly(A)的左侧区域，而反向引物则选取在 Poly(A)位点上，对应cDNA上Poly(T)引物区域，反应程序和所用的反应体系可以按照RT-PCR来。

（Mukherjee S, et al. Front Immunol.2023）

3. RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）验证RNA定位

RNA-FISH（RNA荧光原位杂交）利用荧光标记的核酸探针与细胞内靶RNA分子进行特异性杂交，从而实现对RNA分子在细胞内原位定位的研究。其原理基于碱基配对原则，通过设计与目标RNA序列互补的探针，在细胞经过固定、透化处理后，让探针进入细胞并与RNA结合，通过荧光显微镜观察到的荧光信号可精确显示RNA在细胞内的分布情况。

（Mamontova V, et al. bioRxiv. 2024）

1. 斑点杂交（Dot blot）

斑点杂交（Dot blot）可检测和鉴定 DNA、RNA 和蛋白质，通过显影斑点的有无及颜色的深浅来判断是否有杂交及其杂交强度。在研究 RNA 修饰时，斑点杂交常用于对细胞内总RNA的修饰水平进行定性或半定量分析。具体步骤是：将待测的 RNA 变性后点加在硝酸纤维素膜或 NC 膜上，紫外交联固定后，用m6A或者m5C抗体进行杂交，洗膜，放射自显影，以斑点有无或颜色的深浅代表RNA修饰水平的高低。

（Sun B, et al. Plos Genet. 2022）

2. 质谱检测法（HPLC/LC-MS）

HPLC采用串联质谱的方式，通过结合酶处理和离子打碎，将核酸打断成核苷和碱基，根据出峰保留时间和峰面积，计算m6A和总腺嘌呤的比例，得到mRNA的整体m6A甲基化程度。然而，此种方法无法明确发生修饰的具体RNA以及修饰的具体位置。

（Liu C, et al. Nat Biotechnol. 2022）

3. MeRIP-qPCR

用以对目标基因上的某个修饰位点（以一小段区域的形式，MeRIP法精确不到单碱基）的修饰水平进行验证。其原理同MeRIP-seq测序中MeRIP实验相同，实验基本操作也一致：对RNA进行片段化，然后将片段化后的RNA样品分为二部分：一部分用于免疫共沉淀实验（IP）后作为IP样品，另一部分不进行IP直接作为Input样品。之后再根据实验目的的不同，对两部分RNA片段进行逆转录和qPCR。

（Price A M, et al. Nat Commun. 2020）

4. MeRIP-seq

meRIP-seq是参考Chip-seq发展出来的一种鉴定RNA修饰的方法，目前meRIP-seq已成功应用于m6A和m5C的检测。其原理和步骤为：首先通过polyA捕获mRNA，或者通过rRNA剔除技术去掉rRNA，然后将获得的RNA打成100nt左右的小片段；之后使用修饰特异性的抗体（m6A或m5C抗体）进行免疫共沉淀，含有修饰的RNA片段被富集并回收；进而对回收的RNA进行文库构建、高通量测序和生物信息学分析，通过peak分析鉴定出RNA修饰的区域。

1. 基因敲除

基因敲除是通过不同策略实现目标基因功能丧失以深入探究其生物学作用的关键技术。主要包括插入突变、RNA干扰和CRISPR/Cas9基因编辑三种方法。其中RNA干扰是通过设计与内源mRNA同源的dsRNA，经Dicer酶加工成siRNA，形成RISC复合物切割靶mRNA，抑制基因表达；CRISPR/Cas9系统利用sgRNA指导Cas9蛋白在基因组精确位置切割DNA，通过NHEJ修复机制造成基因功能丧失。

2. 基因过表达

基因过表达是通过将目标基因编码区序列CDS构建到质粒或病毒等载体上，利用载体上的调控元件实现基因在人为控制条件下的大量转录和翻译。这一过程有两种主要策略：瞬时转染和稳定转染。瞬时转染是将外源基因载入细胞但并不整合到染色体中，能在短期内获取高水平的基因表达产物，适用于快速制备少量至中量的重组蛋白；稳定转染则是将目的基因整合到宿主细胞染色体中，形成稳定表达且可以遗传给后代的细胞株。

1. 双荧光素酶检测验证RNA与RNA互作

双荧光素酶检测可用于验证RNA与RNA互作。其基本原理是将待测RNA片段分别与两种酶报告基因构建融合表达载体，各自产生不同类型的荧光信号。实验中，当两种含有所研究RNA片段的融合蛋白在细胞内表达时，若这两种RNA之间存在互作，则会改变各自的构象或稳定性，进而影响各自所连接的荧光素酶活性。通过检测荧光信号强度的变化，即可判断RNA间是否存在相互作用。

2. RNA pull-down验证RNA与蛋白互作

RNA pull-down是通过特定的RNA分子（通常是已知的非编码RNA或mRNA的片段）来富集与之相互作用的蛋白质，以便进一步研究RNA与蛋白的互作。该实验是在已知目的RNA存在下，探究与其结合的蛋白。RNA pull-down是使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液共同孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。再利用游离生物素竞争洗脱复合物，通过Western Blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用，或者结合质谱（Mass Spectrometry）筛选RNA结合的未知蛋白。

3. 酵母双杂交验证蛋白与蛋白互作

酵母双杂交技术是一种利用活体酵母细胞来检测和验证两个目标蛋白质之间是否存在相互作用的方法。其基本原理是将待测蛋白A与酵母转录因子的激活结构域融合表达，同时将蛋白B与转录因子的DNA结合结构域融合表达。当蛋白A和蛋白B在酵母细胞内发生相互作用时，会重新组装成一个完整的功能性转录因子，进而激活特定报告基因的表达。实验步骤主要包括构建融合蛋白表达载体、转入酵母细胞、筛选阳性克隆以及报告基因活性检测。通过观察酵母细胞的生长情况及报告基因表达水平，即可判断两种蛋白质间是否存在相互作用。

参考文献：

1) Kurihara Y, Makita Y, Kawauchi M, et al. Intergenic splicing-stimulated transcriptional readthrough is suppressed by nonsense-mediated mRNA decay in Arabidopsis[J]. Communications Biology, 2022, 5(1): 1390

2) Mamontova V, Trifault B, Gribling-Burrer A S, et al. NEAT1 promotes genome stability via m6A methylation-dependent regulation of CHD4[J]. bioRxiv, 2024: 2024.02. 05.578920.

3) Mukherjee S, Graber J H, Moore C L. Macrophage differentiation is marked by increased abundance of the mRNA 3’end processing machinery, altered poly (A) site usage, and sensitivity to the level of CstF64[J]. Frontiers in Immunology, 2023, 14: 1091403.

4) Liu C, Sun H, Yi Y, et al. Absolute quantification of single-base m6A methylation in the mammalian transcriptome using GLORI[J]. Nature Biotechnology, 2023, 41(3): 355-366.

5) Petazzi P, Menéndez P, Sevilla A. CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout and Knockin Human iPSCs[J]. Methods in Molecular Biology (Clifton, NJ), 2022, 2454: 559-574.

6) Pierattini B, D’Agostino S, Bon C, et al. SINEUP non-coding RNA activity depends on specific N6-methyladenosine nucleotides[J]. Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2023, 32: 402-414.

7) Price A M, Hayer K E, McIntyre A B R, et al. Direct RNA sequencing reveals m6A modifications on adenovirus RNA are necessary for efficient splicing[J]. Nature Communications, 2020, 11(1): 6016.

8) Sun B, Bhati K K, Song P, et al. FIONA1-mediated methylation of the 3’UTR of FLC affects FLC transcript levels and flowering in Arabidopsis[J]. PLoS Genetics, 2022, 18(9): e1010386.

9) Zhang H, Shen X, Sun S, et al. Integrated transcriptome and proteome analysis provides new insights into camptothecin biosynthesis and regulation in Camptotheca acuminata[J]. Physiologia Plantarum, 2023: e13916.

10) Zhou B, Chen N, Chen Z, et al. Prmt5 deficient mouse B cells display RNA processing complexity and slower colorectal tumor progression[J]. European Journal of Immunology, 2023, 53(10): 2250226.

11) Zhu K Y, Palli S R. Mechanisms, applications, and challenges of insect RNA interference[J]. Annual Review of Entomology, 2020, 65: 293-311.