2024年11月26日，复旦大学附属肿瘤医院黄胜林教授课题组在cell子刊《Cell Reports》上发表了题为“RNA splicing junction landscape reveals abundant tumor-specific transcripts in human cancer”的科研论文。该研究使用优化的RNA剪接检测工具ASJA（Assembling Splice Junctions Analysis），系统地检测了来自五种不同样本类型的34,775个样本中的RNA剪接事件。本研究共鉴定了870,389个剪接事件，其中近一半是之前未被注释的。进一步通过来自GTEx项目的88个样品的ONT长读长转录组测序数据和2个癌细胞系的Direct RNA测序进行验证，结果显示75%以上的RNA剪接事件得到了确认。研究发现了29,051个肿瘤特异性转录本（TSTs），这些TSTs与肿瘤干性呈正相关，并且与癌症患者的不良预后有关。此外，TSTs与体细胞突变表现出相互排斥性，并且在具有致癌功能的转座子衍生转录本中过量表达。尤为重要的是，TSTs可以生成用于免疫治疗的潜在新抗原。该研究揭示了RNA剪接的复杂性，并为癌症的诊断和治疗提供了新的方向和希望。贝纳基因协助文章完成ONT Direct RNA测序工作。

RNA剪接是真核细胞中一个关键的酶促过程，它通过去除前体RNA的非编码区段来产生成熟的mRNA，从而调节基因表达和丰富转录组多样性，RNA测序技术虽揭示了人类转录组的复杂性，但对RNA剪接位点变异的系统性和精确性分析仍不足。肿瘤中RNA剪接失调是一种重要机制，已有研究关注特定类型的异常剪接事件，但对肿瘤特异性转录本（TSTs）的广泛鉴定和功能探索尚不充分。

1. 不同人类组织和细胞中 RNA 剪接位点的鉴定

为构建人类不同样本类型的RNA剪接事件图谱，作者收集了癌症、正常组织、细胞和细胞外囊泡等34,775个样本的RNA测序数据。使用优化工具ASJA分析数据，共鉴定出870,389个剪接事件，各样本类型的剪接事件数量存在差异，且多数剪接位点未被注释。为了验证检测的剪接事件的可靠性，作者使用短读长RNA测序数据、来自GTEx项目的88个ONT长读长转录组测序数据和2个癌细胞的Direct RNA测序进行验证，结果显示75%以上的RNA剪接事件在长读长转录组测序中得到了验证，同时对癌症样本的染色质可及性图谱分析表明鉴定的RNA剪接位点来自真实的转录本。

图1 不同人类组织和细胞中 RNA 剪接位点的鉴定。

2. RNA剪接位点的表征

该研究通过对大量转录本异构体的分析，揭示了人类基因组中广泛存在的剪接多样性。研究共鉴定了114,490个异构体，其中首外显子剪接事件最为常见，占总数的40.14%。此外，研究还发现剪接现象不仅限于外显子区域，在内含子和基因间区域同样存在大量的异构体事件。进一步分析显示，蛋白质编码基因相较于长链非编码RNA（lncRNA）基因表现出更高的剪接复杂度，即使在外显子数量相似的情况下也是如此。lncRNA基因具有更长的内含子长度，这可能是影响其剪接模式的一个因素。

图2 RNA剪接位点的表征。

3. 在泛癌中发现肿瘤特异性转录本

研究鉴定到了癌症中特有的剪接位点（TSJs）和转录本（TSTs），尽管整体上癌症组织中的剪接位点数量少于正常组织。本研究设定严格的标准筛选了32,848个TSJs，这些TSJs在不同类型的癌症中分布不均，卵巢癌和睾丸生殖细胞肿瘤中TSTs的数量最多。大部分TSTs不仅在癌症组织中被检测到，也在癌细胞系中广泛存在，这表明TSTs主要由癌细胞产生。通过分析肺癌和结直肠癌的数据集，进一步确认了TSTs在肿瘤细胞中的特异性表达。

图3 在泛癌中发现肿瘤特异性转录本。

4. TSTs与不良预后相关，并可能作为癌症驱动因素

研究进一步探讨了携带肿瘤特异性转录本（TSTs）的癌症患者的临床意义，发现3,130个TSTs与至少一种癌症的生存率相关。通过开发一个基于TST表达和频率的评分系统，对9,555名肿瘤患者的泛癌数据进行了分析，结果显示较高的TST水平与较差的整体生存率、疾病特异性生存率等显著相关。此外，TST数量与肿瘤呈弱正相关，但肿瘤本身与患者生存率无关，表明高TST水平与不良预后之间的联系独立于肿瘤。

5. TSTs在具有致癌功能的转座元件衍生的转录本中富集

转座元件（TEs）是人类基因组的重要组成部分，并对肿瘤和正常组织中的剪接位点产生了影响。研究发现，肿瘤组织中的TE剪接位点（spTEs）数量显著多于正常组织，这暗示TE表达在癌症中被激活。特别地，肿瘤特异性转录本（TSTs）在TEs中高度富集，尤其是长末端重复序列（LTR）类别中的TEs，因为它们较少受到沉默机制的影响，从而具有更强的转录活性。

图4 TSTs在具有致癌功能的转座元件衍生的转录本中富集。

6. TSTs是肿瘤新抗原的一个来源

肿瘤特异性剪接位点（TSJs）或转录本（TSTs）衍生的肽段可能成为癌症免疫治疗的新抗原来源。研究开发了一种用于从RNA-seq数据预测肿瘤新抗原的分析流程，发现在33种癌症类型的29,051个TSTs中，约42.5%具有编码蛋白质的潜力。通过定量评估这些肽段的免疫原性潜力，发现超过一半的肽段在多个患者中与MHC I类分子具有强亲和力。进一步的免疫肽组学分析确认了257个由TST衍生的新抗原由MHC I类分子呈现，且这些肽段在相应样本中可重复检测到。这些发现表明，TST衍生的肽段是潜在的新抗原来源，可能为癌症免疫治疗提供新的靶点。

图5 TSTs是肿瘤新抗原的一个来源。

7. TSTs在肿瘤中引入更多与免疫治疗反应相关的新抗原

研究发现，编码肿瘤特异性转录本（TSTs）的数量与TSJ衍生抗原负荷之间存在显著正相关，这意味着TSJ衍生的抗原可能成为癌症患者的潜在治疗靶点。进一步的研究显示，在接受免疫检查点阻断治疗的转移性胃癌患者中，TST新抗原负荷较高的患者倾向于有更好的临床反应。特别是，所有达到完全缓解的患者都属于TST数量较高的组别。此外，高TST计数的患者组中，多种免疫检查点分子的表达水平显著升高，表明这些患者可能更适合作为免疫治疗的目标人群。

图6 TSJ来源的新抗原及其与免疫治疗反应的相关性。

该研究通过全面分析34,775个样本转录组数据中的RNA剪接位点，构建了人类转录组的RNA剪接图谱，发现大量未注释的剪接位点和TSTs。TSTs与肿瘤干性、预后、突变等相关，可作为潜在癌症驱动因素和新抗原来源，在癌症诊断和治疗中有重要意义。

参考文献：

Li Q, et al. RNA splicing junction landscape reveals abundant tumor-specific transcripts in human cancer. Cell Reports. 2024.

doi:10.1016/j.celrep.2024.114893