英文标题：Senescence suppresses the integrated stress response and activates a stress-remodeled secretory phenotype

发表时间：2024.10

发表期刊：Molecular Cell

IF：15.58

研究团队：美国国立卫生研究院Manolis Maragkakis团队

细胞衰老指的是细胞进入一种无法逆转的生长停滞状态，这种状态通常是由于细胞遭受了不足以致命但足以引发基因组损伤的压力或伤害所导致。细胞衰老的一个重要生物学意义在于它能够阻止那些可能发展成为肿瘤的细胞继续分裂，从而起到预防癌症的作用。然而，随着这些衰老细胞在体内逐渐累积，它们也可能成为多种与年龄相关的疾病发展的推手。

衰老细胞除了永久性停滞外，还表现出其他稳定的表型变化，包括细胞增大和平坦、线粒体功能下降、持续的DNA损伤信号，以及显著增加的衰老相关分泌表型（SASP）。值得注意的是，衰老细胞对细胞凋亡（即程序性死亡）具有较强的抵抗力，这是由于细胞内负责启动凋亡过程的蛋白质水平下降，而那些促进细胞存活的信号通路则被激活和增强。然而，衰老细胞在压力和大分子损伤下的功能维持机制尚未充分研究。

近期，美国国立卫生研究院Manolis Maragkakis团队在Molecular Cell上发表了一篇题为“Senescence suppresses the integrated stress response and activates a stress-remodeled secretory phenotype”的论文，该研究利用Direct RNA测序（DRS）、蛋白质组学和Ribo-seq等技术分析了衰老、静息和细胞增殖状态下的翻译和蛋白质调控的特定模式，定义了衰老细胞在压力下的复杂稳态，揭示了一种由高度抑制的翻译活性驱动的抗压机制。

研究材料：实验对象是IMR-90人肺成纤维细胞，选择一个由DNA损伤诱导的衰老模型进行研究，该模型通过用拓扑异构酶II抑制剂依托泊苷处理细胞来实现。分别获得衰老细胞（Sen-Etop）与早期传代增殖（Cyc）细胞和接触抑制的静止（Qui）细胞进行检测（每组3个生物学重复）。

研究方法：DRS + Ribo-seq +TMT

从衰老、分裂和静止细胞中收集全细胞蛋白裂解物，进行TMT检测。结果显示，与分裂和静止细胞相比，衰老细胞有866种蛋白质显著减少，1,112种蛋白质显著增加。ER应激相关蛋白在衰老细胞中表现出明显的特异性增加（图1F-G），表明衰老细胞表现出基础水平的ER应激。

ER应激由未折叠蛋白反应（UPR）和整合应激反应（ISR）途径监测，这两个途径通过涉及BiP（HSPA5）的共同机制来激活。Western blot分析结果显示，随着衰老的诱导（第2天），eIF2α-P（eIF2α磷酸化，ISR途径的关键事件）水平上升并保持高位。然而，除了在Sen-Etop建立初期有一个短暂的瞬时增加外，ATF4（ISR的核心转录因子，位于eIF2α-P下游激活）的表达一直受到抑制，表明随着衰老的发展，ATF4表达与eIF2α-P之间存在持续的脱钩现象（图1H-L）。

图1 细胞衰老的特征是持续的内质网应激信号，但没有下游的ATF4激活

2. uORF旁路缺乏限制了衰老细胞中ATF4蛋白的表达

为了探究衰老细胞中ATF4蛋白表达受限的机制，作者通过转染过表达ATF4 mRNA实验，结果显示在衰老细胞中，ATF4蛋白的抑制主要是由于uORF2的旁路无效，而非ATF4 mRNA水平的降低。

进一步的Polysome profiling多聚核糖体分析显示，衰老细胞积累了更多的核糖体单体，表明翻译活性降低，且ATF4 mRNA未能进入多聚核糖体，支持了uORF的抑制作用。

Ribo-seq结果显示，衰老细胞中的ATF4 uORF2未被有效旁路激活，与增殖细胞相似，uORF2区域显示出较高的RPF（核糖体保护片段）密度。这些数据表明，尽管eIF2α-P水平升高，衰老细胞中ATF4的抑制性uORF旁路受损（图2）。

图2 衰老细胞中ATF4的翻译在uORF2处受到抑制

3. 衰老的特征是翻译核糖体的整体减少

为了识别翻译抑制的来源，研究者计算了mRNA的翻译效率（TE），发现在衰老细胞中，很少有基因的TE变化达到统计学显著差异。然而，所有mRNA起始位点周围的RPFs分布显示，衰老细胞的总RPFs远少得多，表明衰老细胞中整体范围内的翻译核糖体较少。衰老细胞每单位mRNA的RPFs也显著减少。通过Ribo-seq与DRS reads的线性回归分析显示，与增殖或静止细胞相比，衰老细胞每单位RNA的RPFs大约减少了六倍（图3A-D）。研究团队对其他模型的Ribo-seq数据分析也证实了衰老细胞RPF（核糖体保护片段）显著减少。

Polysome profiling多聚核糖体分析显示，衰老细胞的核糖体数量约减少九倍，蛋白质合成速率显著低于增殖细胞（图 3I）。

质谱结果显示，衰老细胞的翻译相关蛋白、尤其是核糖体蛋白明显减少，确认了rRNA生物合成的降低（图3J）。

图3 衰老细胞表现出整体翻译核糖体的减少

4. 衰老细胞在急性应激下无法激活整合应激反应（ISR）

ISR激活动力学相关实验结果表明，翻译能力降低（静息和衰老）的细胞需要更高的eIF2a-P水平才能产生相似水平的ATF4蛋白。基于纳米孔的DRS分析结果显示衰老细胞的ATF4表达和ISR靶基因转录反应显著降低，表明ISR功能失调。

总的来看，衰老细胞的ATF4抵抗与翻译效率降低和核糖体缺乏相关，导致ISR途径被全面抑制（图4）。

图4：衰老细胞在急性应激下无法激活ISR

5. 应激重塑衰老相关分泌表型（SASP）

虽然衰老细胞对压力的适应性反应极为有限，但确实观察到一些转录本在衰老细胞中的特异性增加，其中包括许多编码参与炎症途径的蛋白质（图5A）。SASP是衰老的标志性特征之一，在此过程中，衰老的细胞会分泌细胞因子、白细胞介素和其他蛋白质。

DRS数据揭示在衰老细胞应激后升高的基因主要与炎症反应和分泌途径相关（图5B），这些应激增强的基因编码了21种分泌蛋白，其中包括几个已确立的SASP因子（图5C）。衰老细胞在承受压力后的48小时内仍保持着异常的SASP因子特异性分泌水平（图5D）。DRS分析发现306个基因表达显著变化，其中53个分泌相关基因的表达上调，且这种变化在应激后48小时内持续存在。

在正常细胞中，ISR的激活后会有一个恢复期，此时eIF2α-P水平主要通过磷酸酶PPP1R15A（GADD34）降低。Western blot分析显示，衰老细胞在Tg处理期间表达了更少的GADD34，并在恢复后维持了高水平的eIF2α-P（图5I-J），这与衰老细胞无法正常激活整合应激反应（ISR, Integrated Stress Response）和应激的持久性反应是一致的。

为了测试无效的ISR是否是导致分泌组重塑反应（SSR, Secretory Signature Remodeling）的原因。在施加应激或非应激处理之前，研究者在Cyc和Sen-Etop细胞中，转染了体外转录的ATF4-D构建体，24小时后收集RNA进行DRS测序，数据分析确认了转染样本中ATF4的显著过表达。同时发现转染ATF4-D构建体可以显著逆转Sen-Etop细胞相对Cyc细胞中由应激引起的SSR因子的增加和减少（图5K）。由此可见，由于衰老细胞中有限的ISR未能解决应激问题，导致了分泌蛋白的持续转录组重塑（图5）

图5 急性应激重塑衰老相关的分泌表型

本研究发现衰老细胞表现出翻译失调和异常的整合应激反应（ISR），导致对压力的敏感性下降。尽管eIF2α磷酸化水平高，但ATF4的翻译受到抑制，导致应激反应减弱。压力增强了衰老细胞的分泌表型，重塑了炎症因子的表达，表现出炎症水平的增加。

参考文献：

Matthew J. Payea, et al. Senescence suppresses the integrated stress response and activates a stress-remodeled secretory phenotype [J]. Molecular Cell, 2024