新冠病毒（SARS-CoV-2，严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型）的各种突变对公共卫生构成了严重威胁。鉴定影响 SARS-CoV-2 复制的新型宿主因子，为探寻可应对未来病毒突变的广谱抗病毒药物新靶点带来了可能。本研究通过多种高通量测序技术筛选了SARS-CoV-2感染调控的潜在宿主因子。研究表明，ACTN4（Alpha-actinin-4）mRNA上的m6A修饰水平降低导致其mRNA稳定性降低和翻译效率下降，最终抑制ACTN4的表达。同时，研究证实ACTN4可以靶向结合nsp12，并作为SARS-CoV-2 RNA和依赖RNA的RNA聚合酶复合物的竞争者，从而阻碍病毒复制。此外还发现两种ACTN4激动剂YS-49和去甲乌药碱能够在Huh7细胞和K18-hACE2转基因小鼠中以剂量依赖的方式抑制SARS-CoV-2感染。总之，本研究揭示了ACTN4在SARS-CoV-2感染中的关键作用，为深入理解关于病毒与宿主细胞之间复杂相互作用提供了新见解，同时揭示了未来抗SARS-CoV-2药物开发的两个潜在候选分子。

在本研究中，作者借助Nanopore Direct RNA测序可以同时检测转录本表达及单碱基水平的RNA修饰位点这一优势，对SARS-CoV-2病毒感染后的不同细胞中的mRNA表达和m6A修饰差异进行分析，明确了SARS-CoV-2感染对宿主细胞中m6A修饰的mRNA具有显著的动态调控作用。

英文标题：Characterization of ACTN4 as a novel antiviral target against SARS-CoV-2

发表时间：2024.9

发表期刊：Signal Transduction and Targeted Therapy

IF：40.8

研究团队：武汉病毒研究所关武祥团队

贝纳基因协助文章完成ONT Direct RNA测序分析工作。

1、SARS-CoV-2感染通过m6A修饰抑制ACTN4表达 

为探究 SARS-CoV-2 感染对宿主基因表达的影响，研究人员使用SARS-CoV-2病毒感染Huh7 和 A549-ACE2 细胞，提取总 RNA 进行Nanopore Direct RNA测序（DRS）。结果显示，感染后ACTN4的mRNA水平显著下降。同时Western Blot 和 RT-qPCR 实验也证实了 ACTN4 蛋白和 mRNA 水平在感染后降低。

图1 SARS-CoV-2感染通过m6A修饰抑制ACTN4表达。

为探究 ACTN4 表达下调的机制，研究人员分析了ACTN4 转录本的m6A修饰水平。DRS测序数据显示，SARS-CoV-2 感染后，其 m6A 修饰水平降低。通过MeRIP实验进一步证实了感染后内源性 ACTN4 转录本中 m6A 修饰水平降低。表明病毒感染影响了细胞中的m6A修饰，并降低了ACTN4等基因的表达。

2、m6A修饰通过影响mRNA稳定性和翻译效率调控ACTN4的表达 

SARS-CoV-2感染改变了细胞中m6A修饰相关蛋白的表达，特别是减少了WTAP和METTL3的表达，同时增加了去甲基化酶ALKBH5的表达。这些变化导致了ACTN4 mRNA上的m6A修饰减少，从而降低了ACTN4的表达。具体来说，WTAP的减少直接导致了ACTN4 mRNA上m6A修饰的减少，降低了其稳定性和翻译效率，进而减少了ACTN4的mRNA和蛋白质水平。相反，过表达WTAP可以提高ACTN4 mRNA的m6A修饰水平，增强其稳定性和翻译效率，提升ACTN4的表达。METTL3 和 METTL14 单独敲低对 ACTN4 影响不大，但同时敲低与 WTAP 敲低的效果类似。ALKBH5 敲除或过表达也影响 ACTN4 表达，FTO 则无调节作用。表明，m6A修饰是调节ACTN4表达的重要机制之一。

图2 m6A修饰及其催化复合体对于ACTN4的表达至关重要。

3、ACTN4抑制SARS-CoV-2复制并与nsp12相互作用 

ACTN4作为一种肌动蛋白结合蛋白，能够抑制SARS-CoV-2的复制，并且与病毒的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）成分nsp12相互作用。研究发现，在Huh7细胞中，ACTN4的敲低导致SARS-CoV-2及其Omicron BA.5变体的N蛋白表达增加，病毒RNA水平上升；相反，过表达ACTN4则抑制病毒蛋白的表达，降低病毒复制。通过免疫共沉淀（co-IP）和间接荧光实验，进一步确认了ACTN4与SARS-CoV-2的nsp12在细胞质中共定位并相互作用。表明，ACTN4通过与nsp12的相互作用来抑制SARS-CoV-2的复制。

图3 ACTN4抑制SARS-CoV-2的复制并与nsp12相互作用。

4、ACTN4与nsp7/nsp8竞争性结合nsp12

通过构建缺失突变体进行co-IP实验，确定了ACTN4通过其Rod结构域与SARS-CoV-2的nsp12的N端motif 相互作用，干扰nsp7和nsp8与nsp12的结合，从而阻碍RdRp复合体的形成和nsp12的RNA加载能力，最终抑制SARS-CoV-2的复制。RIP实验显示，当ACTN4缺失时，nsp12与病毒RNA的结合增加，而ACTN4过表达则抑制nsp12与病毒RNA的结合。表明，ACTN4通过与nsp7/nsp8竞争性结合nsp12，干扰病毒复制的关键步骤，从而发挥其抗病毒作用。

图4 ACTN4特异性地与SARS-CoV-2 RNA竞争性结合nsp12。

5、ACTN4抑制剂和激动剂影响SARS-CoV-2在细胞中的复制

研究发现，Wortmannin 作为 PI3K 和 ACTN4 抑制剂，可降低 ACTN4 转录和表达水平，增强 SARS-CoV-2 复制，且细胞活力降低不到 20%。研究挑选了多种小分子作为激动剂，发现 YS-49 和去甲乌药碱这两种 ACTN4 激动剂能以剂量依赖性的方式抑制病毒复制，且细胞毒性小于 20%，还可促进 ACTN4 转录。这不仅证实 ACTN4 对病毒复制的负调控，还显示其作为抗病毒靶点的潜力。

图5 ACTN4抑制剂和激动剂影响SARS-CoV-2在细胞中的复制。

6、ACTN4激动剂抑制小鼠中的SARS-CoV-2感染

研究进一步探究了ACTN4激动剂YS-49和去甲乌药碱在K18-hACE2转基因小鼠模型中对SARS-CoV-2感染的抑制效果。结果显示，与对照组相比，两种激动剂处理的小鼠肺部和脑部组织中的病毒 RNA 拷贝数和病毒滴度降低，细胞因子表达减少。组织免疫染色也显示，肺和脑组织中SARS-CoV-2 N蛋白的表达显著降低。表明，ACTN4激动剂YS-49和去甲乌药碱在体内具有抑制SARS-CoV-2感染的潜力，可能成为有效的抗病毒药物。

图6 ACTN4激动剂抑制SARS-CoV-2在小鼠中的感染。

本研究采用纳米孔DRS测序和二代测序相结合的方法分析宿主因子与病毒蛋白之间的相互作用，揭示了ACTN4这一重要宿主因子在SARS-CoV-2感染调控中的重要作用，特别是其在抑制细胞病毒复制方面的关键机制。这些发现为开发新的SARS-CoV-2治疗策略提供了可靠的理论基础和潜在的药物靶点。

图7 宿主因子ACTN4与SARS-CoV-2之间复杂相互作用的模型

参考文献：

Zhu, M., Huang, F., Sun, H. et al. Characterization of ACTN4 as a novel antiviral target against SARS-CoV-2. Sig Transduct Target Ther 9, 243 (2024).