代谢是生命最基本的需求。细胞内不同的代谢途径为必需的生理生化活动提供了所需的能量和原料，不同的代谢物作为细胞信号传导和基因表达的调节因子，也在细胞内扮演着重要的角色。尤其是在哺乳动物中，器官之间通过代谢交互来维持能量稳态，因此，了解每个器官在关键营养状态下的代谢调控特征至关重要，尤其是在空腹与进食这两种极端营养条件下。传统的短读长RNA测序虽然广泛应用于基因表达分析，然而其依赖于不完整的基因注释，难以解析基因产生的多种转录本，限制了RNA代谢调控复杂机制的探究。

2024年12月，来自美国国立卫生研究院的曹海明研究团队在Advanced Science期刊(IF=14.3)上发表了题为“Unveiling Tissue-Specific RNA Landscapes in Mouse Organs During Fasting and Feeding Using Nanopore Direct RNA Sequencing”的研究论文。该研究采用纳米孔直接RNA测序（DRS）、ATAC-Seq和短读长RNA-seq等多种技术，全面解析了小鼠在不同营养条件下的组织特异性RNA代谢景观，并揭示了不同组织在转录本和基因表达以及转录后修饰多层面的动态变化，为深入理解器官代谢的复杂调控机制提供了新的视角。

1. DRS揭示组织特异性RNA表达和代谢景观

为了研究小鼠组织特异性RNA代谢情况，在空腹和进食条件下对包括肌肉、肝脏、心脏、肺、白色脂肪、棕色脂肪、脾脏和肾脏等八类小鼠器官进行了纳米孔直接RNA测序（DRS）以及短读长RNA-Seq和ATAC-Seq，并系统分析了基因和转录本表达、m6A修饰和Poly(A)尾长的动态变化（图1A）。通过分析发现不同组织中转录本长度的分布均主要集中在1000~2000nt之间，其中肝脏组织在该范围内的转录本占比最高（图1B）。GSVA分析显示，短读长RNA-seq和DRS数据得到基因的表达模式在不同组织中相近，表明这两种测序方法在揭示生物学功能方面具有一致性（图1C）。

将DRS数据与参考注释（GENCODE vM24）比较发现，近三分之一的转录本与参考注释不同，表明DRS可以发现新转录本，并且这些新转录本在短读长RNA-seq数据中也得到了验证（图1D）。进一步分析发现，组织特异性转录本中近三分之一是组成型转录本，即每个基因中表达量最高的转录本（图1E）。以Aquaporin 7（Aqp7）基因为例，存在一个肾脏特异性新转录本和一个白色脂肪特异性新转录本，两者结构不同进而导致编码蛋白构象的显著差异（图1F）。

此外，还通过DRS鉴定到多个组织特异性的新基因，并通过ATAC-Seq和短读长RNA-Seq以及qRT-PCR等方法验证了其表达（图2）。以上表明，DRS不仅能够发现新的基因和转录本，还能够揭示传统短读长RNA-seq无法解析的组织特异性转录本及其功能差异。

图1 & 图2：DRS揭示组织特异性RNA表达和代谢景观

2. DRS揭示不同组织中响应代谢刺激的可变剪接动态

分析空腹和进食状态下小鼠多个器官的可变剪接事件（图3A~B），结果显示DRS检测到的可变剪接事件显著多于短读长RNA-seq，表明DRS在解析可变剪接方面具有更高的灵敏度，同时PCA分析显示在不同组织间发生的可变剪接事件差别明显，表明可变剪接具有显著的组织特异性（图3C）。进一步分析显示，空腹状态下白色脂肪组织的可变剪接事件变化最为显著，尤其是外显子跳跃事件在所有组织中占据主导地位（图3D）。

以Tropomyosin 1（Tpm1）基因为例，其在白色脂肪组织和肺组织中的外显子跳跃事件表现出显著差异（图3E），并且肺组织中与Tpm1外显子跳跃事件相关的通路主要与化学刺激有关，而白色脂肪组织中则与ATP合成通路相关（图3F-G），由此说明可变剪切导致Tpm1基因在不同组织中产生不同的转录本，进而影响其功能。以上表明，可变剪接在不同组织中具有特异性的调控机制，并且在响应代谢刺激时发挥重要作用。

图3：DRS揭示不同组织中响应代谢刺激的可变剪接动态

3. DRS揭示表达在基因和转录本水平的差异

分析空腹和进食状态下小鼠多个器官的转录本表达情况，结果显示不同组织中转录本水平的表达具有显著的组织特异性，尤其是在白色脂肪组织中转录本表达差异尤为明显（图4A）。以Fatty Acid Binding Protein 4（Fabp4）基因为例，其在白色脂肪组织和棕色脂肪组织中分别表达不同的组成型转录本，这些转录本在脂肪酸结合能力上也存在显著差异，表明它们可能在脂肪代谢中发挥不同的功能（图4B）。

进一步分析显示，空腹状态下不同组织中的差异表达基因和差异表达转录本在通路富集上存在明显区别，如在脾脏组织中，差异转录本显著富集于嘌呤核苷酸代谢过程，而差异基因则没有表现出类似的富集情况（图4C）。此外，在肌肉组织中，尽管大多数基因在基因水平上没有显著变化，但其转录本的变化较为显著，尤其是在甘油三酯代谢通路中，某些基因的特定转录本在空腹状态下显著下调（图4D）。以上表明，DRS可以从转录本水平分析组织表达，揭示基因水平无法捕捉的调控机制，为理解组织特异性代谢调控提供了更全面的视角。

图4：DRS揭示基因和转录本水平的表达差异

4. DRS揭示不同组织中的多聚腺苷酸化变异性

为了研究不同组织中多聚腺苷酸化（Poly(A)）尾长的动态变化及其在代谢调控中的作用，分析空腹和进食状态下小鼠多个器官的Poly(A)尾长度分布，发现不同组织中Poly(A)尾长的分布存在显著差异，如肺组织的Poly(A)尾最长，而心脏的最短；并且在空腹状态下，肺、肝脏和肾脏的Poly(A)尾显著变长，而白色脂肪组织的Poly(A)尾则显著变短（图5A）。进一步分析显示，空腹状态下肺、肝脏、肌肉和肾脏中Poly(A)尾变长的转录本比例增加，而脂肪组织中则减少（图5B）。

以Ferritin Heavy Chain 1（Fth1）转录本为例，其空腹状态下肝脏中Fth1转录本的Poly(A)尾较长，而白色脂肪组织中则较短（图5C）。此外，同一基因的不同转录本在Poly(A)尾长上也存在显著差异。例如，Solute Carrier Family 1 Member 5（Slc1a5）基因的两个不同转录本在白色和棕色脂肪组织中表现出不同的Poly(A)尾长，表明Poly(A)尾长可能在调控同一基因的不同转录本功能中起着重要作用（图5D）。同时富集分析也显示白色脂肪组织中氧化磷酸化通路相关的基因在Poly(A)尾长上表现出显著变化，尽管这些基因在基因水平上没有显著变化（图5E）。以上表明，Poly(A)尾长的动态变化在不同组织中具有特异性，并且在响应代谢刺激时发挥重要的调控作用。

图5：DRS揭示不同组织中的多聚腺苷酸化变异性

5. DRS揭示不同组织中RNA m6A修饰的代谢响应动态

分析空腹和进食状态下小鼠多个器官的m6A修饰情况，结果显示m6A修饰主要发生在编码区（CDS）和3'非翻译区（3'UTR），且在不同组织中的分布存在显著差异，如脾脏中m6A修饰主要分布于3'UTR区域相对较远处（图6A）。PCA分析显示不同组织的m6A修饰水平具有显著的组织特异性，白色脂肪组织和肺组织的m6A修饰水平较为相似，而脾脏则与其他组织显著不同（图6B~C）。同时位点分析结果显示，大多数m6A修饰位点在空腹和进食状态下是共有的，然而也存在特定的修饰位点，表明m6A修饰在响应代谢状态时具有动态调控作用（图6D）。

以Adiponectin（Adipoq）基因为例，其在白色脂肪组织和棕色脂肪组织中的m6A修饰水平表现出显著差异（图6E）。这些结果表明，m6A修饰在不同组织中具有特异性的调控模式，并且参与代谢刺激调控。以上表明，m6A修饰的动态变化在组织特异性代谢调控中可能发挥着关键作用。

图6：DRS揭示不同组织中RNA m6A修饰的代谢响应动态

本研究通过纳米孔DRS技术，结合短读长RNA-seq和ATAC-Seq，全面解析了小鼠在不同营养状态下多个器官的RNA代谢景观。研究不仅发现了大量新转录本和组织特异性基因，还揭示了可变剪接、Poly(A)尾长和m6A修饰在代谢调控中的重要作用。这些发现为理解器官在代谢状态下的功能分化和调控机制提供了新的视角，并为未来的代谢研究和疾病模型研究奠定了重要基础。

参考文献：Jiang C, Li P, Cao H. Unveiling Tissue‐Specific RNA Landscapes in Mouse Organs During Fasting and Feeding Using Nanopore Direct RNA Sequencing[J]. Advanced Science, 2024: 2408054.