2025年1月，Developmental Cell期刊（IF=10.7）在线发表了北京林业大学付玉杰/孟冬研究团队题为”Nanopore RNA direct sequencing identifies that m6A modification is essential for sorbitol-controlled resistance to Alternaria alternata in apple”的研究论文，该研究通过Nanopore 直接RNA测序技术，深入探究了苹果m6A 修饰在调控山梨醇控制的抗病性的关键作用，揭示了山梨醇通过调控m6A甲基转移酶MdVIR1/VIR2的表达，进而影响抗病基因WRKY79和NLR16的m6A修饰，从而增强苹果响应链格孢菌侵染的抗性。贝纳基因在该项研究中承担了直接RNA测序和分析工作。

英文标题：Nanopore RNA direct sequencing identifies that m6A modification is essential for sorbitol-controlled resistance to Alternaria alternata in apple

发表时间：2025.1

发表期刊：Developmental Cell

IF：10.7

糖类在植物对病原体的先天抗性中发挥重要作用。除了作为能量来源外，糖类还可以作为信号分子，引起植物中病原体相关分子模式（PAMP）和效应子触发的免疫反应。山梨醇是苹果（Malus domestica）等蔷薇科果树中的主要光合产物和运输碳水化合物，而山梨醇水平的降低可以通过转录因子MdWRKY79下调NLR基因MdNLR16的表达，导致苹果对链格孢菌（Alternaria alternata）的表型反应从抗性转变为易感性。

越来越多的证据表明，表观遗传调控在糖信号传导等抗病调控通路中起关键作用。m6A甲基化修饰作为典型的表观遗传修饰，在生物体中发挥着重要的作用，包括维持mRNA稳定性、mRNA前体剪切、多腺苷酸化、mRNA运输与翻译起始等。然而，山梨醇是否可以作为信号分子影响调控m6A等表观遗传修饰，以及m6A修饰是否参与山梨醇介导的抗病机制形成，仍不清楚。

检测m6A修饰的常规方法包括甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq/m6A-seq）、miCLIP-seq（m6A单核苷酸分辨率交联免疫沉淀结合高通量测序）和m6A-REF-seq（m6A敏感RNA内切核糖核酸酶促进测序）。然而，这些方法在检测m6A修饰方面均存在局限性。本研究采用纳米孔直接RNA测序（DRS）技术，首次在单碱基水平上获得了苹果叶片m6A修饰图谱，揭示了甲基转移酶MdVIR1/VIR2可以响应山梨醇的变化，并通过m6A修饰正向控制苹果对链格孢菌的抗性，深入解析了m6A修饰在植物防御机制形成的关键作用，为植物病害防治和作物改良提供了理论基础和科学指导。

野生型（WT）苹果（Greensleeves品种）及两个MdA6PR反义株系（A4和A10）的叶片

1. 病原体接种：

从患病的A10叶片分离的链格孢菌（Alternaria alternata）R2菌株接种

2. 外源山梨醇处理：

对WT、A4和A10叶片进行外源山梨醇施加处理

3. m6A修饰水平检测

使用LC-MS/MS技术检测WT、A4和A10株系的RNA修饰（m6A、Um、m6C、Am、Cm、Gm）水平

4. DRS，Illumina RNA-seq

对WT和A10株系的叶片进行DRS和Illumina RNA-seq

5. 甲基转移酶功能验证

1）甲基转移酶鉴定：通过BLAST比对鉴定苹果中的甲基转移酶MdVIR1和MdVIR2

2）基因表达分析：使用RT-qPCR检测MdVIR1和MdVIR2在WT、A4和A10中的表达水平

3）功能验证：构建MdVIR1和MdVIR2的RNAi和过表达转基因植株，通过LC-MS/MS检测转基因植株中m6A修饰水平的变化

6. 抗病性实验

1）病原体接种实验：对WT、A4和A10叶片进行链格孢菌R2接种，检测MdVIR1和MdVIR2在接种后的表达变化

2）抗病性评估：通过瞬时基因沉默和过表达实验，验证MdVIR1和MdVIR2在抗病性中的作用

7. mRNA稳定性与翻译效率分析

1）mRNA稳定性实验：使用转录抑制剂放线菌素D处理，检测MdWRKY79和MdNLR16 mRNA的稳定性

2）翻译效率实验：通过多聚核糖体分析检测MdWRKY79和MdNLR16 mRNA的翻译效率

前期研究发现Greensleeves中山梨醇合成的减少可以导致对链格孢菌的表型反应从抗性转变为易感性。这归因于MdNLR16抗性基因表达的减少，该基因通过MdWRKY79转录因子受山梨醇调控。观察链格孢菌R2侵染WT和两个MdA6PR反义系A4和A10叶片发现，其表型差异与山梨醇水平呈现正相关（图1A–C）。为了确定山梨醇是否影响RNA代谢，对WT、A4和A10进行了六种常见RNA修饰的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，发现A4和A10中的m6A修饰水平显著低于WT（图1D）。以上表明，山梨醇合成的减少可以导致苹果叶片RNA修饰的改变。

图1 Greensleeves苹果叶片中的RNA修饰在山梨醇水平较低的反义MdA6PR品系中发生了改变

为进一步了解A10和WT之间m6A修饰的区别，对两个株系进行了DRS测序并分析了m6A修饰的水平和位点，结果显示A10中m6A修饰的位点显著减少，尤其是在编码区（CDS）和3'非翻译区（3' UTR）（图2A-C）。此外，还发现大多数转录本（>70%）含有两个或更多的m6A修饰位点（图2D）。通过分析m6A修饰的motif，发现RGACH是苹果中最常见的m6A修饰motif（图2E-F）。

图2 Greensleeves苹果野生型（WT）和A10品系的全转录组m6A修饰图谱

探究WT和A10植株m6A修饰的差异，发现其中A10植物中有12010个差异m6A甲基化位点（差异水平>25，q值<0.05），包括2749个超甲基化位点和9261个低甲基化位点，其中大多数位于编码区（CDS），表明m6A修饰在不同区域的分布不均。此外，GGACA是最常见的m6A修饰motif，并且在差异修饰中占比最高（图3A-C）。

根据m6A修饰类型，转录本被分类为超甲基化、低甲基化或复合型（仅包含超甲基化位点或低甲基化位点的转录本分别被指定为超甲基化或低甲基化转录本，而同时包含两种位点的转录本被分类为复合转录本）。A10中的超甲基化转录本通常比WT有更高的表达水平，而低甲基化转录本则相反（图3E-F）。

将m6A修饰差异与表达差异关联分析发现，转录本丰度与m6A甲基化之间存在正相关。同时具有不同M6 A修饰位点的转录本主要富集于植物-病原相互作用、RNA转运、核糖体等通路或功能，推测m6A甲基化可能参与控制植物对病原的响应、基因转录和翻译等过程(图3H-L)。

可变剪接和Poly(A)尾长度分析显示，与WT相比，A10中可变剪接事件和Poly(A)长度减少和变短，并且多数在A10中具有差异可变剪接的基因均受到m6A修饰，表明山梨醇水平变化也可能通过影响mRNA的剪接和Poly(A)长度进而调控基因表达。

图3 m6A 修饰的差异及其对表达的影响

重点关注甲基化酶和去甲基化酶相关基因的表达以确定响应山梨醇处理的差异m6A修饰基因，发现两种甲基转移酶基因MdVIR1和MdVIR2的表达在A10中显著低于WT（图4A），进而推测山梨醇可能通过改变MdVIR1和MdVIR2的表达来影响m6A修饰。

为了确定山梨醇与m6A修饰之间的关系，对WT、A4和A10的叶片进行了外源性山梨醇处理，并检测了MdVIR1和MdVIR2的表达。结果显示在施加外源山梨醇后，WT、A4和A10中MdVIR1和MdVIR2的转录水平显著增加（图4C-D）。分别构建MdVIR1和MdVIR2沉默和过表达转基因株系发现，MdVIR1和MdVIR2的RNAi导致其转录水平显著降低，从而使m6A水平相比WT有所下降（图4E-G）。相反，MdVIR1和MdVIR2的过表达导致其转录水平显著升高，m6A水平高于WT（图4H-J）。以上表明，山梨醇通过改变MdVIR1和MdVIR2的表达来控制m6A修饰。

图4 外源性山梨醇处理及MdVIR1和MdVIR2的RNAi抑制对m6A水平的影响

鉴于MdVIR1/2影响整体m6A修饰水平，推测它们可能在控制苹果对链格孢菌R2的抗性中发挥作用。为了确定MdVIR1/2在抵抗R2中的功能，通过农杆菌介导的瞬时基因沉默技术将MdVIR1-RNAi或MdVIR2-RNAi导入Greensleeves叶片，并以空载体（EV）作为对照接种R2。结果显示MdVIR1和MdVIR2的瞬时抑制导致转录水平显著下降，进而导致感染率显著升高（分别为86.6%和83.3%），而EV对照组仅为3.3%（图5C-E）。然而，在A4和A10叶片中瞬时过表达MdVIR1和MdVIR2使得R2的感染率降低了约15%（图5F-I），这一点也通过转化实验得以验证（图5J-K）。

进一步研究发现，给WT、A4和A10叶片施加50 mM山梨醇3小时可显著提高MdVIR1/2的表达水平，并且A4和A10部分恢复了对R2的抗性，但这种效果可被MdVIR1或MdVIR2的RNAi阻断。综上表明，MdVIR1和MdVIR2对于苹果抵御链格孢菌R2不可或缺，并且它们的作用受到山梨醇的影响。

图5 MdVIR1和MdVIR2在对抗链格孢菌R2时所起的关键作用

先前研究指出，MdWRKY79可以结合到MdNLR16启动子上来响应山梨醇激活MdNLR16表达，而MdNLR16蛋白能识别R2效应蛋白，触发免疫反应，因此重点关注MdWRKY79和MdNLR16是否可能成为MdVIR1和MdVIR2在控制苹果对R2抗性中的靶向基因。

DRS分析显示，MdWRKY79和MdNLR16的mRNA在A10中呈现显著低甲基化，并通过m6A-IP-qPCR得到验证（图6A-D）。RT-qPCR结果显示，在MdVIR1-RNAi和MdVIR2-RNAi叶片中，这两个基因的转录水平也显著低于WT（图6E-F）。

通过分析这两个基因mRNA的m6A水平进一步确定MdVIR1/2是否调节MdWRKY79和MdNLR16的mRNA的m6A修饰。结果显示，在MdVIR1-RNAi和MdVIR2-RNAi植物中，这两个基因的mRNA表现为低甲基化，说明其m6A修饰可由MdVIR1/2调控（图6G-H）。使用放线菌素D抑制转录后，发现MdVIR1/2调控的m6A修饰减缓了这些mRNA的衰减速率并增强了翻译效率（图6I-L）。以上表明，MdVIR1/2通过m6A修饰调控MdWRKY79和MdNLR16的mRNA稳定性和翻译效率，进而影响苹果对R2的抗性。

图6 MdVIR1和MdVIR2正向调控MdWRKY79和MdNLR16的RNA稳定性和翻译效率

本研究使用纳米孔直接RNA测序技术以单碱基分辨率将m6A修饰定位到苹果叶片中的 mRNA 上，发现苹果叶片中山梨醇的合成可以调控MdVIR1和MdVIR2的表达，影响m6A修饰，进而稳定MdWRKY79和MdNLR16的mRNA，增强其翻译效率，最终提高苹果对链格孢菌的抗性。

这一研究不仅阐明了m6A修饰在苹果抗病中的关键作用，还强调了山梨醇作为一种糖醇信号分析，可以通过表观遗传调控植物抗病基因及其转录因子的表达，决定植物与微生物相互作用的结局。这些发现为进一步探索植物借助RNA修饰响应环境变化机制形成提供了新的视角，并为作物遗传改良和品种开发奠定了理论基础。

参考文献：Zhihua Song, et al. Nanopore RNA direct sequencing identifies that m6A modification is essential for sorbitol-controlled resistance to Alternaria alternata in apple. Developmental Cell, 2025