英文标题：5 mC modiffcation of steroid hormone biosynthesis-related genes orchestrates feminization of channel catffsh induced by high-temperature

发表期刊：Environmental Pollution

发表时间：2024.6.3（IF：7.6）

通讯作者：Shiyong Zhang，National Genetic Breeding Center of Channel Catffsh

沟鲶的性别分化具有高度可塑性，受环境因素如温度、pH值等影响，其中温度是最关键的因素。温度变化能够改变芳香化酶活性及激素水平，进而影响性别分化的方向。随着气候变化的加剧，极端温度事件的发生预计将更加频繁。研究表明，表观遗传调控在性别分化过程中扮演重要角色，基因组甲基化是性别逆转的关键因素之一，水温变化导致的甲基化对性腺逆转有显著影响。

该研究采用了全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）和RNA-seq来评估XY假雌性和野生型雌性沟鲶之间的甲基化水平和基因表达水平。这不仅有助于理解温度如何影响沟鲶的性别决定和分化机制，也为深入探讨硬骨鱼类的性别决定和分化机制提供了重要线索。

为了探讨沟鲶在高温环境下雌性化的机制，研究使用了WGBS分析甲基化与性别分化的关系。结果显示，每个样本平均产生27.5Gb数据，覆盖率达30×，超过6.79%的胞嘧啶发生转换，其中mCG是最主要的甲基化类型（占比98.02%-98.50%）。mCG甲基化不仅是样本中的主要甲基化类型，在沟鲶29条染色体上也占据主导地位。此外，研究还发现三条特定染色体上的某些区间内，两组间存在显著的甲基化水平差异，这为理解高温诱导的性别逆转提供了重要线索。

图1 每个样本中甲基化类型分析

图2 高温诱导组（T）与对照组（C）三种甲基化水平比较的Circos图

研究分析了C组和T组基因上下游2kb区域内的甲基化模式，发现T组启动子区域的甲基化水平高于C组，而在其他功能区域未见显著差异。热图显示启动子区域的差异甲基化最为明显。统计发现，6039个基因甲基化上调，4856个基因下调，其中536个基因启动子区域甲基化上调，414个下调。通过GO富集和KEGG通路分析，揭示了与激素介导的信号传导、细胞反应、类固醇激素生物合成等相关的关键生物过程，这些过程与性激素分泌密切相关，对理解高温诱导性别逆转机制具有重要意义。

图3 基因功能区域的差异甲基化水平

图4 DMR区域内T组和C组之间的GO和KEGG通路分析

通过GO富集分析确定了50个具有差异甲基化位点的基因，其中8个与类固醇激素生物合成和代谢通路相关。在C组和T组之间鉴定了12个基因中的15个差异甲基化区域，特别提到esr2b、gmds和Myb蛋白1各有2个差异甲基化区域，而srd5a2虽仅有一个区域（16,608,100–16,608,240），但包含最多的差异甲基化位点。对野生型雄性、雌性和XY假雌性的样本进行差异甲基化验证分析，发现9个位点在野生型雄性和XY假雌性间存在差异甲基化，8个位点在野生型雄性和雌性间存在差异甲基化。尤其值得注意的是，srd5a2基因的一个位点（16608174）在多种比较中均显示出显著的差异甲基化，表明其在性别逆转机制中具有重要作用。

图5 C组和T组srd5a2基因差异甲基化位点的详细显示

对高温诱导组（T）与对照组（C）共6个沟鲶卵巢的转录组测序，结果显示，C组和T组间有1,835个基因差异表达，其中927个上调，908个下调。通过GO富集和KEGG分析，确定了核糖体、剪接体等五个主要信号通路及翻译、肽代谢等关键生物过程，这些与生长相关而非性别决定。尽管分析了包括srd5a2、ar在内的50个与性别相关的差异甲基化基因，但热图分析未显示这些基因在C组和T组间有显著的差异表达。这表明高温诱导的性别逆转可能不直接通过已知性别决定基因的表达变化来实现。

图6 基于RNA-Seq的差异表达基因及富集通路分析

类固醇激素生物合成通路（ipu00140）因在DMR启动子区域显著富集而被选中进行深入分析，以探讨激素代谢与合成机制。此通路揭示了睾酮如何转化为17β-雌二醇和5α-二氢睾酮，分别受芳香化酶和5α-还原酶调控。高温水环境能够诱导沟鲶基因组的异常甲基化，因为高温激活了甲基转移酶的活性。因此，由于srd5a2基因在外显子区域存在差异甲基化位点，基因表达受到抑制，导致5α-还原酶无法正常合成，阻碍了睾酮转化为5α-二氢睾酮的途径。睾酮只能通过芳香化酶的作用转化为17β-雌二醇，这就是高温促进XY沟鲶雌性化的原因。

图7 5α-双氢睾酮和17β-雌二醇合成途径

在本研究中，进行了全面的转录组和全基因组甲基化测序分析，通过KEGG通路和GO富集分析识别出野生型雌鱼和XY假雌鱼间的差异甲基化基因，特别强调了srd5a2基因内的多个差异甲基化位点。重复测试确认了XY假雌鱼中srd5a2有7个独特甲基化位点，其中一个（16608174）能区分XY假雌鱼与正常雌鱼。尽管转录组分析未显示这些基因在两种表型间表达存在差异，但发现srd5a2的甲基化可能抑制其表达，减少睾酮合成而促进17β-雌二醇生成，表明srd5a2在性别分化中起着关键作用。

参考文献:

Xu S, et al. 5mC modification of steroid hormone biosynthesis-related genes orchestrates feminization of channel catfish induced by high-temperature. Environmental Pollution. 2024.

doi:10.1016/j.envpol.2024.124310