英文标题：Binding of PtoRAP2.12 to demethylated and accessible chromatin regions in the PtoGntK promoter stimulates growth of poplar

发表期刊：New Phytologist（IF：8.3）

发表日期：2024年10月

通讯作者：杜庆章教授，北京林业大学

DNA甲基化是植物生长发育过程中重要的表观遗传修饰机制，已在诸多模式植物中得到广泛研究。然而，在木本植物中，DNA甲基化如何影响染色质可及性以及如何介导调控基因表达尚未明晰。本研究采用全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）、染色质可及性测序（ATAC-seq）和RNA测序（RNA-Seq）等多组学技术，探究了毛白杨（Populus tomentosa）生长发育过程中的表观遗传调控关系。通过表观遗传分析，精确定位到了一个关键调控基因PtoGntK，发现DNA甲基化通过影响染色质开放性调控转录因子PtoRAP2.12与杨树生长相关基因PtoGntK的结合能力，进而调控植物生长过程。这一发现为木本植物相关的表观遗传机制解析提供了新的见解。

使用DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂胞苷（5-AzaC）处理毛白杨的两个优良品种LM50和H-3169，结果显示，与对照组相比，处理后的植株表现出生长缓慢、叶片发育异常，并且植株高度和茎直径显著减少。代谢组学分析显示，5-AzaC处理后的植株中脂质和酚酸含量增加，而类黄酮含量减少，差异积累的代谢物主要富集在亚油酸代谢、色氨酸代谢以及类黄酮和类黄酮醇的生物合成途径中。

图1 5-AzaC处理的毛白杨形态变化和DNA甲基化水平

通过WGBS分析显示，5-AzaC处理显著降低了CG、CHG和CHH的DNA甲基化水平，并且差异甲基化区域（DMRs）主要分布在启动子区域。RNA-Seq分析发现，在LM50和H-3169中分别有5871个和6493个差异表达基因（DEGs），其中上调基因主要富集在信号传导和植物激素信号传导途径中，而下调基因主要富集在能量和碳水化合物代谢途径中。

WGBS与RNA-Seq关联分析，结果显示CHG和CHH甲基化与基因表达呈负相关，而CG甲基化与基因表达呈正相关。以上结果表明DNA甲基化在基因表达调控中具有重要作用。

通过ATAC-Seq分析可知，5-AzaC处理后染色质可及性显著增加，特别是在启动子区域和基因间区。差异染色质可及性区域（DARs）主要分布在启动子区。而将WGBS与ATAC-seq关联分析发现，DARs与DMRs在基因组中的分布模式相似，主要位于启动子和基因间区。表明DNA甲基化可以通过影响染色质可及性来调控基因表达。

图2 毛白杨全基因组去甲基化后的染色质可及性状态

WGBS、ATAC-seq与RNA-seq三者关联分析显示，染色质可及性与基因表达呈正相关。高表达基因的启动子区域往往具有更高的染色质可及性。此外在LM50和H-3169中分别鉴定得到91个和22个受DNA甲基化和染色质可及性共同调控的差异表达基因（hypo-DMR-hyper-DAR-DEGs），这些基因主要参与有机环状化合物代谢、碳水化合物衍生物合成等过程。

图3 基因转录由DNA甲基化和染色质可及性共同调控

通过自然群体表达数量性状位点（eQTM）分析，鉴定到61个基因的表达水平与单甲基化多态性（SMPs）显著相关。同时EWAS分析显示，66个基因的SMPs与生长性状显著相关，包括17个与PC1显著相关的基因、14个与高度显著相关的基因和13个与基部茎直径显著相关的基因。以上表明DNA甲基化在调控基因表达和性状形成过程中具有重要作用。

图4 PtoGntK与毛白杨关联和连锁群体中植物生长性状的相关性

通过连锁不平衡分析，定位到47个与生长显著相关的QTLs，其中主效QTL19.1包含有一个低甲基化-高开放性-差异表达候选基因PtoGntK。通过GWAS分析，发现PtoGntK启动子区域存在三个SNPs与生长性状显著相关，并且这些SNPs位于PtoGntK启动子的可及区域。进一步通过敲除和过表达实验进行验证，发现PtoGntK的过表达显著促进了植物生长，而敲除则导致生长迟缓。

图5 PtoGntK正向调控植物生长

通过酵母单杂交实验和双荧光素酶报告实验，证实PtoRAP2.12可以结合到PtoGntK启动子的可及性区域，从而激活PtoGntK启动子的表达。同时凝胶迁移实验显示PtoRAP2.12能够结合到未甲基化的PtoGntK启动子序列，但不能结合到甲基化的序列。表明PtoRAP2.12通过与PtoGntK启动子的非甲基化和可及性区域相互作用，激活了PtoGntK的表达，从而促进植物生长。

图6 PtoRAP2.12结合到PtoGntK启动子，通过DNA甲基化调控植物生长

本研究揭示了DNA甲基化在植物生长中的重要作用，并阐明了DNA甲基化通过调控染色质可及性影响基因表达的机制。具体而言，DNA去甲基化引起染色质可及性的变化，影响转录因子PtoRAP2.12与PtoGntK启动子区域的结合，从而调控PtoGntK的转录，最终影响植物生长。本研究为理解木本植物中表观遗传调控的复杂机制提供了新的视角，并为通过木本植物分子育种改良提供了理论基础。

图7 DNA甲基化调控PtoGntK启动子染色质可及性影响毛白杨生长的模型

参考文献：

He Y, Zhou J, Lv C, Zhang J, Zhong L, Zhang D, Li P, Xiao L, Quan M, Wang D, Zhang D, Du Q. Binding of PtoRAP2.12 to demethylated and accessible chromatin regions in the PtoGntK promoter stimulates growth of poplar. New Phytol. 2025.