pore-c三维组学

一、产品简介

Pore-C是结合染色质构象捕获(3C)和Nanopore长读长测序，检测物种基因组多位点交互作用及关联甲基化修饰的一种新技术。流程更简单，无需生物素标记，无需PCR扩增，可检测复杂的GC富集区域及重复基因组区域，同时保留表观修饰信息，为深入分析三维基因组空间结构特征及染色质多重互作等研究提供条件。

二、Pore-C流程简介

Pore-C是用于研究在原始序列中不相邻基因座基因组之间的相互作用的方法。首先，通过甲醛将基因组DNA交联至组蛋白，甲醛可以保护相互作用基因组的空间邻近性。邻位连接后进行限制性酶切，将交联、相互作用的片段连在一起。这些片段经过大小选择，随后上机测序。

Pore-C protocol 示意图(图源:Oxford Nanopore Technologies)

三、Pore-C 与 Hi-C比较

四、应用场景

1. 构建高质量染色体水平参考基因组；

2. 解析个体基因组三维结构特征（A/B compartment 、TAD、loop检测等）；

3. 解析个体间基因组三维结构特征差异；

（分析不同发育时期、组织部位、环境/处理条件等样本间差异，揭示三维结构变化）

4. 研究空间构象与基因转录调控的关系；

（联合 RNA-seq，研究空间结构变化如何远距离影响基因表达）

5. 研究空间构象与表观调控的相互作用

 （联合 DNA 甲基化、染色质可及性、组蛋白修饰等技术，揭示三维结构变化与表观图谱动态变化关系）

6. 泛3D基因组（鉴定不同品种的A/B 区室、TAD 结构等，揭示物种保守性/品种特异性空间结构进化特征）。

Q1：为什么要开展三维基因组研究？通常可以从哪些角度开展？

基因组在细胞核内的三维空间结构直接决定了基因的调控方式。

开展三维基因组研究，通常可以从“结构分析-功能关联-动态变化”这三个核心角度展开：首先利用Pore-C、Hi-C等技术描绘染色质在空间上的互作模式（如环、TADs区室），进而将这种结构与基因的激活/沉默状态以及细胞的特异功能相关联，最终揭示其在发育、疾病等过程中如何动态演变，从而完整阐释生命调控和疾病发生的空间密码。

Q2：开展三维基因组研究时，选用长读长Pore-C 测序技术的优势在哪里？

Pore-C测序技术的核心优势在于其长读长特性能够无缝整合三维基因组架构与多组学信息。该方法可在单次测序中同步获取染色质空间互作、DNA甲基化状态及核酸序列变异信息。这种多数据整合能力使我们能够：第一，在单分子水平上精准解析涉及多个接触点的复杂染色质结构；第二，直接关联局部表观遗传状态与远程染色质相互作用，揭示甲基化对基因组三维组织的调控机制；第三，无需额外实验即可完成单倍型分型，实现等位基因特异性的三维基因组构象分析。这种整合性方法为理解发育分化及疾病状态下基因组空间组织的调控机制提供了前所未有的多维度视角。

Q3：如何从Pore-C原始测序数据中准确识别有效的染色质互作对？

原始数据是包含多个酶切片段的长读长，需要正确地将它们映射到基因组上，并区分真实的连接事件和实验/测序引入的嵌合体。Pore-C 数据的分析与Hi-C 数据的处理有很大不同，具体可参考我们对 Pore-C 数据分析处理做出的测试和分享：https://mp.weixin.qq.com/s/Sf1OeJRd-XiRKFjY9SbJ7A。

案例一

项目文章 | Pore-C绘制棉花高精度的三维基因组图谱 ( Plant Biotechnology Journal, IF =13.263）

本研究利用最新的多维染色质互作检测技术Pore-C，通过Nanopore长读段测序技术识别染色质多重互作，很好地分析了三维基因组空间结构特征，而且弥补了Hi-C和ChIA-PET等技术的不足。该研究结合了多种三维基因组分析技术 (Pore-C, Hi-C和ChIA-PET)，构建了目前精度最高的陆地棉TM-1三维基因组图谱，分析发现，Pore-C能识别更多拓扑相关结构域间的互作 (TAD clique);并旦研究发现TAD clique越大，所包含的B compartment区域越多，基因表达水平越低，也更趋向于分布在着丝粒附近。

案例二

Pore-C技术首次解析拟南芥基因组多位点相互作用及关联甲基化修饰（Plant Biotechnology Journal，IF =13.263）

本研究使用拟南芥野生型幼苗构建了两个Pore-C文库，分别获得11.7Gb和7.9Gb高质量reads, N50长度分别为2654bp和3006bp。同时对比了Hi-C文库，发现获得相当成对互作数量所需要的Pore-C测序读段数和测序碱基量都更少，证明Pore-C检测基因组互作的效率更高。同时，也证明了Pore-C和Hi-C数据在检测拟南芥基因组互作时具有良好的一致性。此外，该团队使用 Pore-C 数据印证了在拟南芥基因组中存在多个KNOT ENGAGED ELEMENT (KEE)之间互作、多个端粒之间互作的推测。最后，本研究还解析了Pore-C数据中CG, CHG, CHH等甲基化修饰信息，得到的甲基化修饰信号与传统的全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）检测结果高度一致，同时解析了与互作信息关联的CG甲基化，发现空间距离较近的互作片段之间存在较高的甲基化水平关联性。

案例三

项目文章 | Pore-C 助力实现牛油果 T2T基因组构建（Horticulture Research，IF=7.6）^[3]

该研究利用Pacbio HiFi、ONT Ultra-long和Pore-C测序技术，组装了无间隙的牛油果 T2T 水平基因组。新发现了12号染色体上的一个核仁区，并阐明了牛油果着丝粒的结构特征。在牛油果基因组中鉴定了 376 个 NLR 基因，并从中筛选出与牛油果疾病响应分子机制相关的关键基因。此外，还鉴定出了与脂肪酸生物合成途径相关的 128 个基因，这些基因的差异表达模式为我们理解牛油果的脂肪酸生物合成提供了宝贵见解。

参考文献

[1] Huang, Xianhui et al. Multi-omics mapping of chromatin interaction resolves the fine hierarchy of 3D genome in allotetraploid cotton. Plant biotechnology journal. 2022.

[2] Li, Zhuowen et al. Pore-C simultaneously captures genome-wide multi-way chromatin interaction and associated DNA methylation status in Arabidopsis. Plant biotechnology journal. 2022.

[3] Yang, T. et al. A telomere-to-telomere gap-free reference genome assembly of avocado provides useful resources for identifying genes related to fatty acid biosynthesis and disease resistance. Horticulture Research. 2024.

一、Pore-c实测数据展示

二、结果展示

贝纳基因相同基因组HIC (100X）与Pore-c (20X） 挂载的实测比较

（Pore-C 挂载在高重复区域显示出前所末有的互作信号高连续性）

Pore-C技术构建三维互作图谱

（在A/B隔间、TAD互作频率及边界鉴定上，Pore-C均展示出较Hi-C更好的效果）

高表达基因中的高阶接触优先被去甲基化

参考文献

Deshpande, Aditya S et al. Identifying synergistic high-order 3D chromatin conformations from genome-scale nanopore concatemer sequencing. Nature biotechnology. 2022.